α AMILASA

α AMILASA

La α-amilasa (alfa-amilasa) es una enzima que cataliza la hidrólisis de los enlaces alfa-glucosídicos, de los polisacáridos alfa glucosídicos de alto peso molecular, tales como el almidón y el glucógeno, liberando glucosa y maltosa. Es la principal amilasa encontrada en humanos y otros mamíferos. También se encuentra presente en semillas que contienen almidón como reserva alimenticia, y es secretada por muchos hongos. Se encuentra en la saliva humana ycataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal . Elalmidón está formado por dos tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina,ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineal es deglucosas unidas por enlaces a- C1- C4, mientras que la amilopectina tiene, además deestos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1- C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejandodextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos.

Para medir la actividad enzimática de la a- amilasa, se utilizará un test colorimétrico quedetecta el almidón. Par a ello se contará con una solución de iodo/ ioduro de potasio( I2/ I K) , ya que el almidón en presencia de esta solución adquiere una coloraciónazulada característica. Esto tiene una explicación física: el iodo se coloca en elinterior de la hélice que forma la amilosa ( en las regiones hidrofóbicas) , formandoun complejo de color azul. Cuando la a- amilasa actúa, degrada la amilosa, sedesintegra la hélice y por tanto en presencia de I2/ I K ya no dar á una coloración azul.Por lo tanto, en este TP mediremos la desaparición de sustrato ( evidenciada por eltest colorimétrico) para determinar la actividad de la enzima. Además, analizaremoscómo afectan las distintas condiciones en que actúa la enzima ( pH, temperatura,concentración de NaCl ), así como los efectos que pueden causar diferentes pretratamientos ( proteinasa, calor ).La dilución óptima nos indicará cuánto debemos diluir la saliva para que se logre elefecto acromático dentro del rango propuesto ( 2- 8 minutos) .

La reacción enzimática (la imagen se abrirá en una nueva ventana)

Porcino alfa-amilasa pancreática (PPA) actúa sobre grandes polímeros de hidratos de carbono lineales en bonos internos. Los productos de hidrólisis tienen alfa-configuración. actividad de alfa-amilasa está presente en todos los organismos vivos; sin embargo, las enzimas varían notablemente incluso de tejido a tejido dentro de una sola especie.

Historia:

Las alfa-amilasas fueron nombrados por Kuhn en 1925, debido a que los productos de hidrólisis están en la configuración alfa. En 1930, Ohlsson descubrió otra amilasa, lo que produjo un beta-manosa. Le dio el nombre de beta-amilasa. En 1947, la enzima se cristalizó primero de páncreas de cerdo por Meyer et al. , Y Danielsson determinó su peso molecular. En 1952, Caldwell et al.Informó sobre un método de purificación mejorado.

Los inhibidores de la alfa-amilasa se ​​reportaron en ya en 1975 (Marshall y Lauda 1975). La primera estructura cristalina de alfa-amilasa era de Aspergillus oryzae y se determinó en 1979 (Matsuura et al. 1979). Esta estructura de la resolución 6 Å se mejoró a una resolución de 3 Å al año siguiente (Matsuura et al. 1980).

En la década de 1980, las secuencias de aminoácidos de las dos formas (PPAI y PPAII) se determinaron (Kluh et al. 1981, y Pasero et al. 1986). Las tres estructuras cristalinas tridimensionales de cada forma se determinaron en la década de 1990 y se encontró que efectivamente idéntica (Qian et al. 1993, y Gilles et al. 1996). La secuencia de ADNc completa se determinó por Darnis et al. En 1999.

El trabajo reciente con alfa-amilasa ha incluido el aislamiento y el estudio de los efectos de los inhibidores de fuentes naturales (Narita y Inouye 2009, y Suda et al. 2011). Los investigadores también han estudiado los efectos de los hidratos de carbono de la envolvente en la estabilidad de la enzima (Gopal et al. 2008) y se analizó la unión de los inhibidores con el objetivo de diseñar nuevos inhibidores (Najafian et al. 2011).

especificidad:

alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de los enlaces alfa-1,4-glucano internos en polisacáridos que contienen 3 o más unidades de D-glucosa unidas-alfa-1,4, obteniéndose una mezcla de maltosa y glucosa. Ver también Takeshita y Hehre (1975).

Composición:

La enzima es una glicoproteína (Beaupoil-Abadie et al. 1973). Su única cadena polipeptídica de alrededor de 475 residuos tiene dos grupos tiol libres, cuatro puentes disulfuro, y contiene una Ca fuertemente unido ²⁺ (Granger et al. 1975 y Steer et al. 1974). Existe en dos formas (PPAI y PPAII), que tienen propiedades enzimáticas idénticas y masa molecular de 55,4 kDa, que sólo difieren en la movilidad electroforética y Pi (Cozzone et al. 1970b, Marchis-Mouren y Pasero 1967, y Darnis et al. 1999 ).

Las estructuras de las dos formas de PPA consisten en un dominio mayor A (residuos 1-99 y 170-404), organizadas como una (alfa / beta) ₈ -barril que contiene un bucle (dominio B). Tras el dominio C-terminal C (residuos 405-496) es un motivo dominante griego de diez beta-cadena (Darnis et al. 1999).

Las características moleculares:

Animales alfa-amilasas son codificadas por dos loci, AMY1 (salivales) y amy2 (páncreas). La longitud total amy ADNc contiene 1565 pb. Contiene un péptido señal de 15 aminoácidos y un marco de lectura abierto de 1536 nt (ORF). Región no codificante A 29-nt 3 'va seguida de una cola corta de poli (A).

Animales alfa-amilasas contienen cinco regiones conservadas incluyendo cuatro en o alrededor de la (alfa / beta) 8-barril y una secuencia corta cerca del extremo C-terminal del dominio B (Janecek 1993 Svensson 1994, y Janecek y Balaz 1995). Alfa-amilasas pancreáticas humanas y porcinas son el 87,1% idéntica, con sustituciones de aminoácidos solamente 64 aminoácidos.Ratón y rata alfa-amilasa comparten una identidad de 85,5% con la de porcino. Los aminoácidos 304-310 se conservan entre mamíferos alfa-amilasas y se cree que están involucrados en el mecanismo enzimático